李炜、Robert Siliciano团队获得消灭潜伏HIV病毒的新药物靶点和药物组合

fentao 发布于 2022-11-27 11:38防艾公益341 次浏览抢沙发

人类免疫缺陷病毒，又称为艾滋病毒 (HIV)，可以说是病毒家族里最广为人知，也是最臭名昭著和最难以对付的一种病毒。尽管科学家经过几十年的努力开发了有效的抗艾滋病的疗法（“鸡尾酒疗法”），但现在全球仍然有超过三千万人是艾滋病毒的携带者。HIV病毒难以被完全消灭的一个重要原因是这些携带者体内的“潜伏期病毒” (latent HIV) 。这些潜伏期病毒数量非常稀少，很可能每百万个T细胞里面才有一到两个。在抗病毒的治疗过程中，它们就像伪装成平民的杀手，难以被药物和人体的免疫系统识别并杀灭。但是一旦停药，它们就有可能被重新激活并复制，从而引发新一轮的疾病。

基于这个原因，如果我们能够找到药物去消灭这些潜伏病毒，那么我们就有可能完全治愈HIV。一种消灭它们的方式就是尽量在治疗的过程中激活它们，使得它们能够及时地被药物和免疫系统清除，从而减少它们潜伏的可能性。这种方式也称为”Shock and Kill”。目前为止已经有几款正在临床实验的候选药物，用这种方式来减少患者体内潜伏病毒库 (reservoir) 的大小，但是已有的单个药物和药物组合并没有得到很好的效果。所以，寻找新的候选药物或者药物组合成为完全治愈艾滋病毒的一项重要且急迫的任务。

近日，Science Translational Medicine杂志上线了由华盛顿特区的儿童国家医学中心(Children’s National Hospital)的李炜课题组和约翰霍普金斯大学的Robert Siliciano课题组合作的文章，Genome-wide CRISPR screens identify combinations of candidate latency reversing agents for targeting the latent HIV-1 reservoir（一作：戴维维），使用全基因组CRISPR筛选的方式寻找新的消灭潜伏的HIV病毒的药物靶点和药物组合。该文章发现并验证了两种不同类型的药物组合能够大幅度地激活潜伏的HIV病毒，并找到了之前未发现的药物靶点。

研究人员首先在Jurkat细胞系里使用HIV-GFP建立了多克隆的细胞系模型，通过多轮细胞激活并使用流式筛选的方式，模拟HIV病毒反复激活并潜伏的状态。接下来，研究人员使用几种不同的激活方法来进行全基因组CRISPR筛选，包括TNF-alpha, PMA/I, T细胞受体(TCR)，以及一种新发现的能够激活非经典NF-kB通路 (non-canonical NF-kB) 的小分子药物AZD5582，也是SMAC (Mimetics of the second mitochondrial- derived activator of caspases) 抑制剂的一种。

使用MAGeCK-VISPR软件（李炜在刘小乐实验室开发的CRISPR 筛选的计算工具），研究人员能够集成多组CRISPR筛选数据进行综合分析，并找到了在不同激活方法里发挥不同功能的关键基因。例如MAP3K14，非典型NF-Kb通路的关键因子，只在AZD5582刺激的情况下出现。而一组总共128个基因在各个不同的刺激方法的情况下都出现，证明它们确实是激活潜伏HIV所必须的关键基因。这些基因里面，很多就有已知的跟HIV转录相关的基因，例如CCNT1 (cyclin T1), RELA (p65), 等等。

接下来，研究人员在这个细胞系统里添加小剂量的候选药物，并同时进行CRISPR筛选试验，找出哪些基因敲除之后使得细胞能高表达HIV-GFP。通过这种方式可以寻找药物组合能够最大程度地激活潜伏的HIV病毒：如果在药物A的刺激下，敲除基因B能够增加HIV-GFP细胞的数量，那么理论上药物A加上靶向基因B的药物连用也能获得同样的激活效果。基于这种方式，研究人员测试了两种药物: AZD5582和SAHA, 也称为vorinostat,一种蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACi），并寻找可以和它们一起连用的药物靶点。

在全基因组筛选的数据的基础上，研究人员还通过 “药物可及性” (tractability) 的分析方式，考虑四个因素来确定靶点的优先级：该基因激活潜伏HIV病毒的效率，敲除该基因在正常细胞的毒性，这个基因在T细胞里面的表达量，以及有没有已知的药物去靶向这个基因。这种方法确定了多个可能的现有的药物靶点，而得分最高的是两个表观遗传药物相关的靶点：BRD2，也是BET抑制剂 (bromodomain inhibitor) 的其中一个靶点；HDAC2，HDACi的其中一个靶点。有意思的是，在AZD5582刺激的条件下，评分最高的基因之一是HDAC2，而HDAC2正是SAHA的其中的一个靶点。

而在SAHA刺激的条件下，BIRC2基因的评分非常高，而BIRC2也是AZD5582的其中一个靶点。因此，AZD5582和相对应的表观遗传药物连用，包括HDACi（例如SAHA）以及BETi（例如JQ1），理论上都能大幅激活潜伏期的HIV病毒。基于这些发现，研究人员在现有的细胞系以及在HIV携带者病人的T细胞里面进行了验证试验，确认了AZD5582+HDACi, AZD5582+BETi都能获得“协同”效应(synergistic effect)。

除了已知的药物靶点，我们能不能找到新的药物靶点，从而为新药研发提供新的方向？为了回答这个问题，研究人员同时也研究了很多“未成药”的基因；也就是说，并没有任何已知的药物能够有效地靶向这些基因。敲除这些基因与AZD5582和SAHA同时作用，都能够在细胞系模型中极大增加潜伏HIV病毒的表达。这些基因里面，敲除三个基因(NFKBIA, CYLD, YPEL5)都能在多个HIV病毒携带者的T细胞里和AZD5582和SAHA产生协同效应。也就是说，如果能有新的药物靶向这三个基因，那么这些新的药物就可以和已知的药物(AZD5582, SAHA)连用从而产生1+1>2的效果。

最后，研究人员还观察到了一个有意思的现象：所有在筛选中挑选的基因都能在细胞系验证试验里面产生了良好的协同效果，但是并非在所有的HIV病毒携带者的T细胞里有效果。这意味着现有的细胞系还有着它的局限性；而为了更好的研发新药，需要科学家们开发出更能准确模拟HIV病毒携带者的细胞模型。总的来说，在这篇文章中，研究人员使用全基因组CRISPR筛选的方式寻找能激活潜伏期HIV病毒的关键靶点，并建立了一种新的分析方法能够确定靶点的优先级。通过这种方法找到的药物靶点和药物组合，在细胞系和HIV病毒携带者的T细胞里的后续实验中都验证了筛选的结果。

注：约翰霍普金斯的Robert Siliciano实验室现正招收博士后。